本节要点
- 量「像不像」用 RMSD：整体 1 Å，高置信度部分 0.6 Å，已经与实验结构自身的一致性基线持平；
- 侧链 93% 大致正确、80% 完美拟合，略低于实验结构的 98% 与 94%；
- 低置信度区、多结构域的相对摆放、膜蛋白的域朝向都不可信——先看 pLDDT 与 PAE，再下结论。
这一页是你上一页的量化版。上一页回答的是“凭什么说它可信”（CASP 盲测 + 四种实验交叉验证），这一页回答的是“可信到什么程度、误差多大、哪些部分不能用”。
页面开头那段加粗的三句话就是全文的论点，我把它拆开看：
- 高置信度区通常非常接近实验结构，可以用来设计下游实验
- 低置信度区可能偏离很大
- 它把折叠和大部分侧链位置搞对了，但你要原子级精度（比如催化机制的细节），它可能达不到
一、方法论：怎么量“像不像”——RMSD
要谈“精度”，先得有把尺子。这里用的是 RMSD（Root Mean Square Deviation，均方根偏差）。
定义：把两个相似结构叠合之后，计算所有对应原子之间距离的平均值。公式上，是先在刚体变换下取最小值，再开方：
三个要点：
- 必须先叠合。RMSD 不关心你在空间里的绝对位置和朝向，只关心叠合后形状差多少，所以优化掉旋转 R 和平移 t。
- 单位是埃（Å），1 Å = 0.1 nm。参照一下量级：一个 C–C 单键长约 1.54 Å。所以 1 Å 的 RMSD 差不多是“三分之二个键长”的骨架偏移。
- 标尺：完全相同的结构 RMSD = 0 Å；超过 2–3 Å 就算差别很大了。
然后是这一页最有方法论价值的操作——它没有孤立地给出 AlphaFold 的 RMSD，而是先建立了一条基线：
同一个蛋白，由不同实验解出的两个结构，它们互相之间的中位 RMSD 是 0.6 Å。
这一步很关键。因为实验结构自身也不是完美地重复的——晶体堆积环境不同、分辨率有限、柔性区解析程度不同，都会让同一个蛋白的两份实验坐标差上零点几埃。0.6 Å 就是实验方法自身的“噪声底”。有了这条基线，你才能判断 AlphaFold 的偏差是“模型不行”还是“本来就这么点量级”。
二、四组数字
| 比较对象 | 中位 RMSD |
|---|---|
| 实验结构 vs 实验结构（基线） | 0.6 Å |
| AlphaFold 模型 vs 实验结构（整体） | 1 Å |
| AlphaFold 高置信度部分 vs 实验 | 0.6 Å |
| AlphaFold 低置信度部分 vs 实验 | 可到 2 Å 甚至更高 |
怎么读这张表：
整体 1 Å，是与实验结构之间非常接近的水平——它和基线 0.6 Å 已经同一量级了。而且别忘了上一页的数字，十年前这个领域是 GDT_TS ≈ 60 的水平。
高置信度部分的 0.6 Å，正好等于基线。这是这张表的点睛处：在模型自己说“我确定”的那些区域，它的精度与实验结构自身的一致性持平（on par）。换句话说，这些区域的误差已经小到“模型和实验的分歧”与“两个实验之间的分歧”差不多——这是“fold 通常是对的”的定量表达。
低置信度部分能飘到 2 Å 以上。这个数字已经踩到“差别很大”的界线。所以整体那 1 Å 不是均匀的 1 Å，而是被低置信度区拖出来的——这也解释了为什么下一页要专门讲置信度怎么读。
三、侧链：93% / 80% 的账
骨架对了不等于侧链都对。同一批分析（Terwilliger et al., 2023）给出的侧链统计：
| 大致正确 | 完美拟合 | 与实验数据不符 | |
|---|---|---|---|
| AlphaFold2 预测 | 93% | 80% | 7% |
| 实验结构（对照） | 98% | 94% | — |
结论是：绝大多数侧链是对的，但比实验结构略逊一筹。
这里有个页面明确标注的适用边界，很重要：这个统计不能外推到无序区和低置信度建模的部分。原因很直白——那些区段的氨基酸侧链构象“基本是随机的”，既然参照系本身就是一团分布，谈“对错”没有意义。
四、页面里的 Figure 11：苯丙氨酸羟化酶
可拖动旋转、滚轮缩放：AF-Q818B4-F1，按 pLDDT 上色（蓝色为高置信）。
图配的是苯丙氨酸羟化酶（phenylalanine hydroxylase），拿 AlphaFold 模型 AF-Q818B4-F1 和已沉积的实验模型（灰色，PDB ID: 7VGM）对比。整体结构叠合没问题，但模型里有好几个侧链的位置摆错了（就是主链上伸出来的那些小的分叉结构）。
我顺手去 AlphaFold 数据库查了这个条目的底细，有两个细节值得知道：
- Q818B4 不是人源的 PAH（人源是 P00439）。它是蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus ATCC 14579） 的苯丙氨酸-4-单加氧酶，基因 BC_4352，全长 584 个残基。所以别顺手把它和苯丙酮尿症（PKU）那个人源酶对应上。
- 它的置信度其实很高：全局 pLDDT 91.69，78.4% 的残基落在 >90 的“very high”档，只有 2.2% 是最低档。
第二个细节才是这张图真正的教学价值所在——“整体极自信”和“一堆侧链摆错”可以同时成立。
为什么会这样？因为 pLDDT 本质是在预测 lDDT-Cα（local Distance Difference Test − Cα，局部距离差异测试）这个指标，它主要反映主链几何的局部正确性。课程自己的 pLDDT 页面写得很谨慎：
pLDDT > 90 被视为最高精度档，此时主链和侧链通常都能高精度预测；而 pLDDT > 70 通常对应“主链正确、部分侧链摆错”。
注意“通常”两个字——它是趋势，不是保证。pLDDT 不是侧链旋转异构体（rotamer）的置信度。
这就把页面开头那句“要原子级精度可能不够”落地了：如果你关心的是催化残基的精确朝向、酶活性位点的精细几何、药物结合口袋的立体匹配，主链对了是必要条件，但不充分。这类问题请把 AlphaFold 模型当假设而不是结论。
五、低置信度区：两种成因，必须区分
低置信度区常常对应内在无序区（IDR，就是你前面学过的那些“浅能量景观”片段）。但页面点出第二种可能：它也可能只是表示 AlphaFold2 没有足够信息来自信地预测这个结构——典型就是 MSA（Multiple Sequence Alignment，多序列比对）稀薄的孤儿蛋白，同源序列太少，共变信号不足以定出结构。
这两种情况的处理方式完全相反：前者是“结构本来就没有”，后者是“结构有，只是这次没算出来”。所以看到低 pLDDT 不能直接下“这是 IDR”的结论，得配正交实验（NMR、SAXS、单分子荧光）才能定案。
六、柔性 linker 连接的多结构域——这不是错误，是“答非所问”
这是页面里我认为最容易被误读的一段，值得单独说清。
场景：一个蛋白含几个结构域，域之间由柔性 linker 连着。页面说：这些域的相对位置很可能本来就不固定——在细胞里它们就没有明确摆位，除非进入某个大复合物之后才被固定下来。
于是 AlphaFold2 的表现是：
- 每个结构域单独预测得又准又自信
- 域与域之间的相对位置基本是随机的
注意页面用的词是 “mirroring their behaviour in real life”——它镜像了真实行为。
所以这不是模型算错了。模型答对了“每个域长什么样”，但它没办法回答“这些域怎么摆”这个本来就没有唯一答案的问题。而这类不确定性会反映在另一个置信度指标 PAE（Predicted Aligned Error，预测对齐误差）上——PAE 的图会把这一坨红出来。
页面的实际建议就一句：不要从这类结构域的相对位置里得出任何生物学结论。
这跟你之前学的两块内容严丝合缝：序列结构映射不对称（序列→结构的输出是系综里的一个样本，不是分布）和同序列多稳定态（构象信息在模型里但默认没有出口）。区别只是这次“系综”不是出现在残基层面，而是出现在结构域层面的相对摆放上。
七、膜蛋白：它不知道膜平面存在
页面最后落在膜蛋白上，而且理由是决定性的：AlphaFold2 根本不知道膜平面在哪。
后果就是，它可能把某些结构域摆到真实细胞里会撞上膜的位置上。这不是它没算好，是这个约束从来没进过它的信息——训练数据是 PDB 里的坐标，不含膜的坐标系。
同样地，域朝向的不确定性会出现在 PAE 图上（等你读到 PAE 那页会更清楚：PAE 是 N×N 的矩阵，第 i 行第 j 列画的是“把残基 j 对齐后，残基 i 的预期位置误差”，所以域内是深蓝、跨域块是红，正好把“域内准、域间糊”这张图直接显影出来）。
总结成三条可操作的判读规则
- 先看置信度，再看结构。 别拿到 .pdb 就开始量距离、做对接，先看 pLDDT 和 PAE 把“哪些部分可信”划出来。
- pLDDT > 90 的区域：骨架可信到与实验结构自身一致性持平的 0.6 Å 水平；侧链大体可信，但涉及原子级精度（催化、结合口袋）仍需警惕——Figure 11 那个 78% 残基都在最高档的模型就是活例子。
- 低 pLDDT / 高 PAE 的区域：先分清是“真无序”还是“信息不足”，然后不要从这些区域（尤其是域间相对位置）推出任何生物学结论。
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